W13 Topoizomerazy, Biochemia, STRUKTURA I FUNKCJE BIALEK
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Białka i kwasy nukleinowe Notatki te z pewnością zawierają błędy i braki, więc jeżeli ktoś takowe zauważy prosiłbym by nie zachowywał tego dla siebie, tylko dał mi znać na maila postaram się je jak najszybciej poprawić/ uzupełnić. Slajdy dostępne pod adresem hasło: mimoza Wykład 13 Topoizomerazy: Źródła problemów topologicznych w DNA [ciągle pamiętamy, że DNA w chromosomach jest w pętlach!] 1. Transkrypcja – polimeraza rozplata przed i zaplata po sobie. Niestety lepkość otoczenia wraz z RNA ciągnącym się za nią uniemożliwia jej rotowanie wokół DNA. Generuje ona więc pozytywny superheliks przed sobą, a za nią powstaje kompensacyjnie negatywny. Dlatego w intensywnych transkrypcyjnie rejonach np. rRNA białka usuwające superheliks są niezbędne do prowadzenia trnskrypcji. 2. Replikacja – w jej trakcie jest superheliks jest generowany przed widełkami. Dodatkowo powstają wtedy katenony. 3. Inne – np. wszczepienie nukleosomu. Jako, że są tu zafiksowane wszystkie wartości wprowadzenie neagtywnego superheliksu (to nukleosom) powoduje powstanie kompensacyjnie pozytywnego, który będzie usuwany przez Topoizomerazę I Wszystkie one są rozwiązywane przez topoizomerazy Potrzebne są dwa podejścia: 1. Przy superhelisach – wystarczy naciąć 1 nić 2. Katenony i węzły – trzeba przeciąć obie nici i stworzyć „bramkę” przez którą jeden podwójny fragment cząsteczki będzie przeciągnięty względem drugiego. Topoizomerazy nie potrzebują energii do cięcia, gdyż robią to z wytworzeniem wiązania między ich Tyr i fosforanem z DNA (tzw. kompleks rozszczepialny), które potem dostarczy energii do odtworznia wiązania między fragmentami DNA. Niektóre topoizomerazy (typu II) zużywają ATP, jednak do swoich zmian konformacyjnych w trakcie rozwiązywania problemów topologicznych. Topoizomerazy są stare ewolucyjnie, gdyż są niezbędne do operowania nie-superkrutkimi fragmentami DNA. Topoizomerazy typu I – nacinają 1 nić i rozwiązują superhelisy. Należą do nich topoizomerazy nieparzyste – I i III Topoizomerazy typu II - nacinają 2 nić i usuwają katenony i węzły. Należą do nich topoizomerazy parzyste – II i IV Zasadniczo są 3 modela jak one działają: • Grupa I – mają ją prokarioty i eukaroty. Są to białka z dziurką w środku (pod II domeną) i z przerwą między domeną I i III. IV tworzy zawias. Jeden fragment przecinanego DNA jest trzymany kowalencyjnie a drugi niekowalencyjnie. Nić nieprzecięta przechodzi przez powstałą lukę a energia do tego pochodzi z napięcia torsyjnego. Do przeprowadzenia tej reakcji potrzebny jest rejon gdzie cząsteczka jest stopiona (zwykle AT bogaty). Oznacza to również, że cząsteczka ta jest specyficzna dla negatywnego superheliksu a jej jedno kłapnięcie usuwa jedno oplecenie. Należy do niej Topoizomeraza IA i poniekąd odwrotna gyraza • Grupa II – mają prawie tylko eukarionty. Jest to zawiaz z dwoma wargami i 2 dwoma helisami linkerowymi, funkcjonującymi jako podstawka dla DNA i dającymi lekkie opóźnienie niezbędne dla procesywności tego enzymu. Działa przecinając jedną nić i pozwalając na swobodny obrót względem jej drugiej. Pozwala to na usuwanie zarówno negatywnego jak i pozytywnego superheliksu. Jego tempo zależy od gęstości superheliksu, ale średnio jest to 5-6 obrotów na jedno przecięcie (czyli czas jest stały). Należy nadmienić, że sam mechanizm jest troszkę inny dla pozytywnego i negatywnego superheliksu. Należy do niej Topoizomeraza IB Z praktycznego punktu widzenia należy dodać, że jest fajna metoda klonowanie go wykożystująca (dokładnie wirusowego odpowiednika). Mamy wektor w który chcemy klonować z doczepionym kompleksem rozszczepialnym. Do tego dodajemy nasz produkt PCR z dodanym niespecyficznie 1 nukleotydem. Topoizomeraza dokańcza wtedy swoją reakcję i pięknie liguje nam konstrukt. • Grupa III – di, albo tetramery, zawsze symetryczne z dwóch części (jedno, albo dwu łańcuchowych). Mają dziurkę i dwoje uszów i będą przecinać 2 niciowe fragmenty. Przecięty fragment jest trzymany przez dwie tyrozyny a drugi jest przenoszony przez zmianę konformacyją białka na drugą stronę. To tu zużywane jest ATP. Jedna taka aktywność usuwa, więc dwa oplecenia! Do tej grupy należą gyraza , Topoizamerazy IA , IB i IV (ta z czterech części;)) U S. cerevisiae wykazano, że można zastąpić topoizomerazę I przez II, ale nie na odwrót! U eukariontów w replikacji biorą udział dwie topoizomerazy: Topoizomeraza I – usuwa tworzony przez Polimerazę DNA pozytywny superheliks. Topoizomeraza Iiα (ona jest replikacyjna) – usuwa powstające rekatenony za Polimerazę DNA Gyraza – enzym bakteryjny wprowadzający superheliks do cząsteczki DNA. Oddziałuje aż przez 200 nukleotydów i przed jego przecięciem nawija na siebie DNA. Odwrotna gyraza – występuje w hipertermofilach. Ma dwie części, halikazową i topoizomerazową IA. DNA jest przez nią cięte a superheliks wprowadzany. Istnieje specyficzność t opoizomeraz I i II do superhelikalnego DNA. Wykazują one równięż pewną specyficzność co do sekwencji np. topoizomeraza I do fragmentów telomerowych. Topoizomerazy są często celem dla leków: 1. Antybiotyków – np. ciprofloksacyna jest inhibitorem gyrazy 2. Antynowotworowych – np. kamptotecyna jest inhibitorem topoizomerazy I Działanie kemptetocyny polega na stabilizacji kompleksu rozszczepialnego, co utrudnia ligację. Stan ten jest bardzo groźny i dlatego zwykle trwa bardzo krótko. Szczególnie ma to znaczenie, gdy DNA jest transkrybowane, lub replikowane i właśnie tu działa terapia opierając się na zderzeniu aparatu replikacyjnego z kompleksem. Należy pamiętać, że jest od groma czynników wpływających na wrażliwość topoizomerazy na kamptetocynę. Występują również leki, które skierowane są przeciwko pierwotniakom opierające się na tym, że ich topoizomeraza, choć podobna do naszej jest nieidentyczna. Należy zwrócić uwagę, że jako, iż leki te działają przez stabilizację kompleksu rozszczepialnego lepiej działają na komórki, gdzie jest go (i co za tym idzie enzymu) dużo. [ Pobierz całość w formacie PDF ] |