właściwości kwasów nukleinowych, Farmacja, Biochemia
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
13. WŁASNO Ś CI I SKŁAD KWASÓW NUKLEINOWYCH 1. Preparatyka kwasów nukleinowych z dro Ŝ d Ŝ y Zasada: W komórce – zarówno w j ą drze, jak i w cytoplazmie – wi ę kszo ść kwasów nu- kleinowych wyst ę puje w formie nukleoprotein. Izolowanie takich poł ą cze ń wy- maga zastosowania łagodnej procedury ekstrakcyjnej, poniewa Ŝ pod wpływem st ęŜ onych soli nukleoproteiny dysocjuj ą na kwas nukleinowy i białka. Opisana poni Ŝ ej preparatyka kwasów nukleinowych z dro Ŝ d Ŝ y polega na rozbiciu komó- rek oraz usuni ę ciu białek z ekstraktu za pomoc ą anionowego detergentu siar- czanu dodecylu sodu (SDS), który jednocze ś nie hamuje aktywno ść rybonukleaz (dzi ę ki denaturacji białek). Kwasy nukleinowe wytr ą ca si ę z ekstraktu za pomo- c ą etanolu. W komórkach dro Ŝ d Ŝ y wi ę kszo ść kwasów nukleinowych stanowi ą kwasy rybonukleinowe, natomiast DNA nie osi ą ga 2% całkowitej zawarto ś ci kwasów nukleinowych. Zastosowana metoda ekstrakcji kwasów nukleinowych z tego materiału biologicznego (dro Ŝ d Ŝ y) pozwala otrzyma ć preparaty, które przede wszystkim zawieraj ą RNA o wysokiej masie cz ą steczkowej. Preparaty te charakteryzuj ą si ę nisk ą zawarto ś ci ą DNA (około 0,5%) oraz stosunkowo ni- skim stopniem zanieczyszczenia białkami (do 2% preparatu). Wykonanie: · W zlewce ogrza ć do wrzenia 55 ml 6% roztworu SDS na płytce elektrycznej, stale mieszaj ą c. Doda ć 25 g rozdrobnionych dro Ŝ d Ŝ y piekarskich i dalej ogrzewa ć przez 1 minut ę . Przenie ść zlewk ę z ekstraktem z płytki elektrycznej do wrz ą cej ła ź ni wodnej i ogrzewa ć nast ę pne 2 minuty, stale mieszaj ą c. Eks- trakt schłodzi ć do temperatury 4 0 C, po czym wirowa ć przy 3000 obr./min przez 10 minut w wirówce laboratoryjnej. · Supernatant (płyn znad osadu) zla ć do cylindra miarowego, zmierzy ć obj ę - to ść , po czym wla ć do dwóch obj ę to ś ci ozi ę bionego w lodzie 95% etanolu. Po upływie 5 minut odwirowa ć osad wytr ą conego kwasu nukleinowego, w warunkach opisanych powy Ŝ ej. Osad rozpu ś ci ć w 10 ml 0,1 M NaOH. Roztwór nukleinianu zachowa ć do nast ę pnych ć wicze ń . 7 2. Rozpuszczalno ść kwasów nukleinowych Zasada: Kwasy nukleinowe maj ą charakter polianionowy, wynikaj ą cy z bogactwa reszt fosforanowych w ich strukturze, dzi ę ki którym maj ą odczyn kwasowy. Dlatego wolne kwasy nukleinowe dobrze rozpuszczaj ą si ę w roztworach zasadowych, natomiast słabo w rozcie ń czonych kwasach i w wodzie. Kwasy nukleinowe w wodnych roztworach tworz ą koloidy, z których łatwo mo Ŝ na je wytr ą ci ć od- czynnikami odwadniaj ą cymi, np. etanolem, który jest powszechnie wykorzy- stywany w metodach izolacyjnych do oczyszczania kwasów nukleinowych. Wykonanie: · Do 0,5 ml roztworu 0,1% nukleinianu dodawa ć kroplami 0,1 M HCl a Ŝ do wytr ą cenia osadu kwasu nukleinowego. Nast ę pnie doda ć kroplami 1 M NaOH, a Ŝ do ponownego rozpuszczenia osadu. · Do 0,5 ml roztworu nukleinianu doda ć 1 ml 95% etanolu. Zaobserwowa ć wytr ą canie si ę osadu kwasu nukleinowego. 3. Hydroliza kwasowa RNA Zasada: Wykrywanie obecno ś ci kwasów nukleinowych w materiale biologicznym opie- ra si ę na ich wielkocz ą steczkowym charakterze, charakterystycznych własno- ś ciach absorbowania ś wiatła UV oraz na analizie jako ś ciowej składu kwasów nukleinowych. Wi ę kszo ść charakterystycznych reakcji dla poszczególnych składników kwasów nukleinowych, zachodzi dopiero po hydrolizie makrocz ą - steczki na składniki proste. W tym celu nale Ŝ y przeprowadzi ć hydroliz ę che- miczn ą kwasu nukleinowego. DNA jest odporne na działanie mocnych zasad, pozostawiony w roztworze 1M NaOH przez 20–40 godz. w temp. 37 0 C nie do- starcza Ŝ adnych produktów hydrolizy zasadowej. W tych warunkach RNA roz- pada si ę całkowicie do mieszaniny 2 ’ - i 3 ’ -monofosfonukleozydów. Mo Ŝ liwe jest to dzi ę ki obecno ś ci grupy –OH przy atomie C2 ' rybozy, która w ś rodowisku zasadowym uczestniczy w tworzeniu nietrwałych cyklicznych nukleozydo-2 ’ ,3 ’ - -fosforanów, rozpadaj ą cych si ę z równym prawdopodobie ń stwem do nukleozy- do-2 ’ - i nukleozydo-3 ’ -fosforanów. Brak grupy –OH przy atomie C2 ' deoksyry- bozy uniemo Ŝ liwia powstanie cyklicznych fosforanów nukleozydów podczas hydrolizy zasadowej DNA i jest to przyczyn ą oporno ś ci kwasów deoksyrybo- nukleinowych na działanie zasad, dlatego DNA hydrolizuje si ę w ś rodowisku kwasowym. Hydroliza kwasowa kwasów nukleinowych dostarcza ró Ŝ nych pro- 8 duktów zale Ŝ nie od st ęŜ enia stosowanych kwasów, czasu trwania hydrolizy i temperatury. Wi ą zania glikozydowe ró Ŝ ni ą si ę wra Ŝ liwo ś ci ą na działanie kwa- sów, tzn. w nukleotydach purynowych wi ą zania glikozydowe s ą bardziej la- bilne ni Ŝ w nukleotydach pirymidynowych. Dlatego krótkotrwałe ogrzewanie (w 100 0 C), zarówno DNA, jak i RNA z kwasami (np. HCl) o małych st ęŜ eniach (ok. 1 M) dostarcza pocz ą tkowo kwasów apurynowych, które s ą ła ń cuchami polinukleotydowymi, pozbawionymi zasad purynowych, a dopiero w dalszym etapie hydrolizy (po 1 godz.) dostarcza mononukleotydów pirymidynowych, pentoz i kwasu fosforowego. Natomiast pod działaniem mocnych kwasów mi- neralnych (np. 72% roztwór HClO 4 ) i w podwy Ŝ szonej temperaturze (100 0 C przez 1 godz.) z obu typów kwasów nukleinowych nast ę puje uwolnienie zasad purynowych i pirymidynowych, pentoz i kwasu fosforowego. Wykonanie: · Do probówki odmierzy ć 5 ml nukleinianu z dro Ŝ d Ŝ y, doda ć 10 ml 10% H 2 SO 4 i ogrzewa ć we wrz ą cej ła ź ni wodnej przez 45 minut. Otrzymany hydrolizat zachowa ć do nast ę pnych ć wicze ń . 3.1. Wykazanie obecno ś ci puryn Zasada: Zasady azotowe reaguj ą z jonami Ag + (lub Cu + ), tworz ą c nierozpuszczalne sole kompleksowe. Wykonanie: · Do 1 ml hydrolizatu nukleinianu doda ć st ęŜ onego amoniaku do odczynu lekko alkalicznego, ocenionego papierkiem wska ź nikowym. Roztwór przes ą czy ć , je ś li nie jest klarowny. Do klarownego przes ą czu doda ć 0,3 ml 1% roztworu AgNO 3 . Wytr ą ca si ę osad soli srebrowych puryn nierozpuszczalnych w amo- niaku. 3.2. Wykazanie obecno ś ci kwasu fosforowego Zasada: Kwas fosforowy reaguje z molibdenianem amonu w obecno ś ci HNO 3 , w wy- niku czego powstaje nierozpuszczalny fosfomolibdenian amonu, Ŝ ółto zabar- wiony osad. 9 Wykonanie: · Do 0,5 ml hydrolizatu nukleinianu doda ć st ęŜ onego amoniaku do odczynu oboj ę tnego, ocenionego papierkiem wska ź nikowym. Nast ę pnie doda ć 0,5 ml st ęŜ onego HNO 3 , po czym 2 ml 5% roztworu molibdenianu amonu. Probów- k ę z prób ą wstawi ć do wrz ą cej ła ź ni wodnej i ogrza ć do wrzenia. Podczas ogrzewania pojawia si ę Ŝ ółty fosfomolibdenian amonu, co jest dowodem, Ŝ e w hydrolizacie był kwas fosforowy. 4. Odró Ŝ nianie DNA od RNA Nukleotydy buduj ą ce DNA zawieraj ą 2 ’ -deoksy-D-ryboz ę , a RNA D-ryboz ę . Istnienie ró Ŝ nych pentoz jest podstaw ą chemicznego odró Ŝ niania preparatu DNA od RNA. 4.1. Wykrywanie DNA metod ą Dischego Zasada: W ś rodowisku kwa ś nym (st ęŜ onego H 2 SO 4 i CH 3 COOH) deoksyryboza (wolna i zwi ą zana w nukleotydach purynowych) tworzy z difenyloamin ą produkt kon- densacji o barwie niebieskiej. Ta barwna reakcja jest konsekwencj ą powstania aldehydu hydroksylewulinowego z deoksyrybozy pod wpływem działania kwa- su siarkowego i octowego. H O C H 2 O O H d e o ks yryb o za O H C H 3 C O O H H 2 S O 4 H O C H C H 2 + N k o m p le ks b a rw y n ie b ie s kie j C H 2 C O d ife n ylo am in a C H 2 O H n a ld e h yd h yd ro ks yle w u lin o w y ω - 10 Nast ę pnie aldehyd ten kondensuje z difenyloamin ą , tworz ą c produkt o barwie niebieskiej, którego maksimum absorpcji przypada przy długo ś ci fali 600 nm. Oprócz deoksyrybozy reakcj ę t ę daje tak Ŝ e kwas N-acetyloneuraminowy. Po- wstały produkt w ś rodowisku oboj ę tnym lub zasadowym ma barw ę Ŝ ółt ą . De- oksyryboza zwi ą zana z zasadami pirymidynowymi i ryboza nie daj ą tego od- czynu. Wykonanie: · Przygotowa ć w statywie 4 probówki. Do ka Ŝ dej z nich odmierzy ć po 0,5 ml roztworów, odpowiednio: kwasu nukleinowego nr 1 do pierwszej, kwasu nu- kleinowego nr 2 do drugiej, deoksyrybozy do trzeciej i wody destylowanej do czwartej (próba ś lepa). Do wszystkich probówek wprowadzi ć po 1 ml odczynnika Dischego (1% di- fenyloamina w H 2 SO 4 i CH 3 COOH lodowaty) i wymiesza ć . · Probówki z analizowanymi próbami wstawi ć do wrz ą cej ła ź ni wodnej i ogrze- wa ć przez 10 minut. · Zinterpretowa ć uzyskane wyniki, wyja ś ni ć , która próba kwasu nukleinowego jest roztworem DNA. 4.2. Wykrywanie RNA metod ą orcynow ą Zasada: Wolne pentozy, fosfopentozy, jak te Ŝ zwi ą zane w nukleotydach purynowych (lecz nie pirymidynowych) w kwasach nukleinowych podczas ogrzewania ze st ęŜ onym HCl przechodz ą w furfural. HO OH HO O OH O CHO + 2 furfural CH 3 H 2 O CH 3 CH 3 orcyna O barwny kompleks Powstały furfural tworzy z orcyn ą , w obecno ś ci katalitycznie działaj ą cych jo- nów Fe +3 , kompleks o trwałej barwie zielonej, którego maksimum absorpcji przypada przy długo ś ci fali 610 nm. W tych warunkach deoksyryboza reaguje 10-krotnie słabiej od rybozy, dlatego odczyn ten dla DNA wypada ujemnie. Re- 11 · [ Pobierz całość w formacie PDF ] |