W11i12 oddizalywania bialko-bialko i sieci bialkowe, Biochemia, STRUKTURA I FUNKCJE BIALEK
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Białka i kwasy nukleinowe Notatki te z pewnością zawierają błędy i braki, więc jeżeli ktoś takowe zauważy prosiłbym by nie zachowywał tego dla siebie, tylko dał mi znać na maila postaram się je jak najszybciej poprawić/ uzupełnić. Slajdy dostępne pod adresem hasło: mimoza Wykład 11 Oddziaływania białko-białko: Są uniwersalne (w sensie powszechne). Charakteryzują się różnymi poziomami swoistości/ stabilności. Rodzi to problem potrzeby weryfikacji fizjologicznej prawdziwości zidentyfikowanych kompleksów, gdyż okazuje się, że w badaniach interaktomicznych potrafią wychodzić kompleksy np. między białkami z innych kompartmentów komórkowych. Różnica siły wiązań to nawet dwanaście rzędów wielkości! np. Słabe wiązanie → kinazy ze swoimi substratami Mocne wiązanie → trypsyna ze swoim inhibitorem (do ich oddzielenia trzeba zdenaturować białka) Bywają duże, wieloskładnikowe kompleksy w których siła oddziaływania różnych elementów jest różna, jak np. w Polimerazie II RNA . Średnio powierzchnia oddziaływań między białkami wynosi kilkanaście procent, jednak wariancja jest tu bardzo duża, np. dla dimeru fosfatazy ? To 5% a dla represora Trp 30%. Oddziaływania biorące w nich udział: • Hydrofobowe – istotniejszy wpływ niż w układzie DNA-białko, często nieswoiste, ale stabilizujące (o dużym wkładzie energetycznym) np. kieszonka Phe • Wodorowe – też istotny wpływ energetyczny i bardziej specyficzne np. między glutaminami • Mostki solne – np. między Lys i Glu Powierzchnie oddziaływania zwykle są płaskie, chociaż bywają dopasowane zarówno kształtem, jak rozkładem ładunków. Struktury II rzędowe, zasadniczo wszystkie biorą udział. Między helisami amfipatycznymi np. białka Fos , Jun , czy UHM . To ostatnie ma motyw RRM w którym na platformie z β-harmonijki układa się RNA, ale przyciskające dwie helisy oddziałują z białkowym ligandem. Białka Mago i Y14 są przykładem oddziaływania ze sobą dwóch różnych struktur II rzędowych, tu 2 helisy z Mago i β-harmonijka z Y14 . Kompleksy zasadniczo dzielą się na obligatoryjne (tworzące strukturę IV rzędową) i fakutatywne (oddziaływania mogą być regulowane). Czynniki wpływające na oligomeryzację, to: • pH, siła jonowa i temperatura (w komórce mało regulowane) • stężenie podjednostek • wiązanie ligandu • modyfikacje posttranslacyjne (głowna kontrola) np. bromodomena w białku p53 oddziałuje jedynie z acetylowanymi resztami histonów, albo białko cdc25 dopiero po fosforylacji dimeryzuje. Nietypowy zegar biologiczny sinic, nie opiera się na ekspresji genów a kontroli oddziaływań przez fosforylację. Układ składa się z 3 białek: KaiC – główne białko mające dwa zależne od siebie miejsca fosforylacji, na Ser i Thr. Ufosforylowanie Thr pozwala na fosforylację Ser i defosforylacja Thr pozwala na defosforylację Ser. KaiB – wiąże KaiA z KaiC , kiedy KaiC jest ufosforylowane na Ser. KaiA – propaguje (?) fosforylację KaiC i hamuje jego defosforylację. Zegar działa następująco: 1. KaiC autofosforyluje się na Thr. Jako, że KaiA jest dostępne sprzyja temu. 2. Fosforylacja Thr pozwala na fosforylację Ser. 3. Ufosforylowana Ser powoduje wiązanie przez KaiB KaiA do KaiC 4. Wiązanie KaiA powoduje, że zwalnia fosforylacja i w końcu zaczyna się defosforylacja 5. Następuje defosforylacja Thr i wtórnie defosforylacja Ser 6. Prowadzi to do uwolnienia KaiB i KaiA i cykl rusza z pkt 1 Całość trwa 24h. Przykład kontroli przez wiązanie ligandu – białka G . Przyłączenie ligandu powoduje zamianę GDP na GTP, co obniża powinowactwo tej podjednostki, która oddysocjowuje i będzie mogła być ponownie związana po pewnym czasie dzięki wykazywanej aktywności wolnej GTPazy. Helisa prolinowa – segment łańcucha polipeptydowego o specyficznej sekwencji występowania proliny. Dużo Pro powoduje zwinięcie się w tę helisę (dzięki temu, że Pro ma ograniczoną ilość kątów Φ), gdzie co trzecia reszta ma identyczne ułożenie jak pierwsza (1, 4, 7 etc.). Prowadzi to do powstania regularnej, hydrofobowej ścieżki i regularnie ułożonych reszt aa i grup karboksylowych w łańcuchy, co daje świetny materiał do oddziaływań białko-białko. Często znajduje się ona znajduje się ona na końcu łańcucha i tam wystaje jako sztywne fragmenty. Wydaje się, że oddziaływania białko-białko gwarantowane przez fragmenty bez Pro są szybsze, jednak niespecyficzne i muszą być obecne inne elementy gwarantujące ową specyficzność. Sporo kinaz wpływa na oddziaływanie białko-białko wpłaśnie przez fosforylację motywów prolinowych, często w centrach aktywnych samemu takowe posiadając np. ERK i CDK Domany oddziałujące z helisami prolinowymi to min. SH3 i WW SH3 – rozpoznaje motyw PXXP, jak widać rozpoznawana jest przez niego helisa Pro w obie strony (symetrycznie) a specyficzność jest gwarantowana przez Glu i aa dodatnio naładowany położony obok. Domena ta nie daje swoistości a szybkość rozpoznawania! Występuje w takich kinazach jak Src , czy PI3K domena WW [nazwa od dwóch kluczowych Trp] – również do szybkiego rozpoznawania, np. w białku Nedd widać, że inne fragmenty gwarantują swoistość. Acetocholinoesteraza ma domenę PRAD z α-helisą, którą oddziałuje z helisą Pro białka ColQ Należy pamiętać, że występują dwie energetycznie do siebie zbliżone konformacje przy Pro. 94% cis i 6% trans , gdyż ciężko w siebie przechodzą co jest kontrolowane enzymatycznie (przez izomeraza peptydyloprolylową). Kinematyka powstawania kompleksów białko-białko – w czasie oddziaływania ligand dopasowuje się do miejsca wiązania na podstawie „fałszywych połączeń” i dlatego ważne są szybkie domeny do „złowienia” go. Taką samą zresztą funkcję pełnią motywy nieustrukturalizowane („łowienie na wędkę”) Istnieją białka o dużej ilości partnerów, pełniące funkcję „rusztowań” np. domena WB w RbApA8 , albo w β-arrestynie (wyłączanie receptorów), czy białkach łączących się z białkami rozkładającymi second massengery. CDK zyskują specyficzność substratową dzięki łączeniu różnych cyklin (jeśli ktoś chce się dowiedzieć, że to nieprawda polecam monograf „regulacja cyklu komórkowego w rozwoju i nowotworzeniu”) Kontrola tak ważnego procesu jak apoptoza również opiera się na oddziaływaniach białko-białko. Metody badań: Wysokoprzepustowe badania interaktomiki – TAP (tandem affinity purification) i Y2H. Wysokoprzepustowe badania proteomu – żele 2-D i spektroskopia mas. Drożdżowy system dwuhybrydowy (Y2H) – rozdzielamy na dwie części czynnik transkrypcyjny genu reporterowego i dofuzjowujemy do niego badane białko, sprawdzając czy będzie transkrypcja. Zalety → proste, szybkie, tanie Wady → bywa nieswoiste i nie wszystkie białka można tak badać, np. hydrofobowe, albo stopujące transkrypcje Inne metody: • dwie części ubikwityny i po dimeryzacji przcięcie reportera • dwie części fluorochromu • FRET – przekazanie energii pomiędzy fluorochromami Chromatografia powinowactwa – głównym problemem są niespecyficzne wiązania, więc często dodaje się swa tagi i i po pierwszej selekcji odcina się pierwszy i selekcjonuje na drugi. Koimmunoprecypitacja – przeciwciałami wyciągamy białko razem ze wszystkim z czym się wiąże (oczywiście poza miejscem na które mamy przeciwciało). Potem puszczamy na żel i analizujemy na MS. PhD (Phage Display) – prezentacja fagowa. Mamy bibliotekę fagów, gdzie na powierzchni kapsydu prezentowane są wszystkie możliwe kombinacje aa (zwykle fregmenty 7-12aa) i sprawdzamy które są wiązane do naszego białka. Możemy przeprowadzić kilka cykli namnożeń i wiązań (dostajemy specyficzność) a na końcu sekwencjonujemy. Metoda wymiany deuter/ wodór – fizykochemiczna, dzięki temu, że możemy blokować kontrolując pH i potem analizując na MS stwierdzać jej powierzchnie. Metoda z unieruchamianiem białek na fazie stałej – Jako, że w trakcie łączenia możemy sprawdzać jak zmieniają się właściwości optyczne układu w czasie rzeczywistym pozwala ona na określenie parametrów kinematycznych. Mikromacierze białkowe – wysokoprzepustowa, analogiczna do DNA. Dobór metody zależy od etapu na jakim prowadzimy badania. Czy są one wysokoprzepustowe (łowienie na wędkę), czy preparatywne (na fazie stałej). Niekture pozwalają lokalizować wewnątrz komórki a inne dają informację o kinematyce. Modelowanie kompleksów – proces analogiczny do modelowania białek i również najskuteczniejsze okazują się metody przez homologię Wykład 12 Sieci interakcji: Można je różnie korelować np. z występującymi kompleksami, albo z lokalizacją subkomórkową. Jaki mają sens? 1. Znajdowanie węzłów – widać, że ich stopień koreluje z letalnością mutantów 2. Znajdowanie szlaków metabolicznych 3. Znajdowanie uniwersalnego , powtarzalnego rdzenia między gatunkami/ genomami/ proteomami 4. Określanie istotności białka w jakimś procesie np. starzeniu się człowieka Podstawową trudnością jest potrzeba filtrowania wyników uzyskanych metodami wyokoprzepustowymi. Zwykle korzysta się z metod klasycznych i potem składa bioinforamtycznie tworząc nowy obraz. Istnieją różne rodzaje węzłów np. białka tworzące kompleksy wykluczające (z 1, albo z 2, albo z 3) z jednej stron a białka platformowe (ze wszystkimi naraz) z drugiej. Dlatego dla zwiększenia informacyjności sieci stworzono „legendy” np. standard MIM (Molecular Interaction Map) i zapisano w nim na slajdzie 12 sieć dla receptora EFG Ostatnio aktualizowane: 2009r. [ Pobierz całość w formacie PDF ] |